La quadreria dei Girolamini è frutto delle committenze relative alla chiesa monumentale e delle donazioni di alcuni collezionisti. Nata agli inizi degli anni Venti XVII secolo grazie ad una donazione di Domenico Lercaro, un facoltoso sarto e commerciante di tessuti, è la prima quadreria pubblica di Napoli. Nel 1622 Domenico Lercaro lascia con testamento alla Congregazione dell'Oratorio tutti i suoii mobili e le opere d'arte; della sua collezione facevano parte l'Incontro tra Cristo e san Giovanni Battista e il San Girolamo diFrancesco Gessi terminati dopo la morte del testatore. Un altro importante nucleo collezionistico è quello della famiglia Milano giunto ai Girolamini nel 1631.
L'originaria sede della quadreria era la sacrestia maggiore posta dietro l'abside della chiesa monumentale, dove oggi sono esposti tra gli altri anche alcuni dipinti facenti parte della chiesa. Non a caso, Domenico Lercaro subordinò il lascito testamentario all'onere di esporre le sue opere d'arte o nella tribuna della chiesa o nella sacrestia che è rimasta sede della prestigiosa pinacoteca fino alla realizzazione di una riorganizzazione dell'allestimento espositivo nel 1961. L'apertura più recente della quadreria risulta quella del1995, dopo una chiusura durata quindici anni a causa del terremoto dell'Irpinia del 1980. Una parte della quadreria è ora collocata nella sacrestia della chiesa, un'altra è in alcuni ambienti del convento posti al primo piano a cui si accede dal chiostro degli aranci.
Le opere conservate sono esposte in ordine cronologico e comprendono un periodo che va dagli inizi del Cinquecento alla metà del Settecento. Uno dei quadri più antichi è l'Adorazione dei Magi di Andrea Sabatini da Salerno del 1513, uno dei primi pittori dell'Italia meridionale a mostrare di avere ben assimilato la lezione di Raffaello e Leonardo da Vinci. Tra le opere cinquecentesche spiccano il San Sebastiano di Giuseppe Cesari detto il Cavalier d'Arpino e un'Adorazione dei Magi di Federico Zuccari; notevoli anche unGiudizio di Pilato derivante da un'incisione di Luca di Leida e un Salvator Mundi di Bartholomaus Spranger. Cinquecentesca è anche la Madonna con Bambino di scuola greco-cretese.
Ben rappresentato è il Seicento napoletano colto sia nel suo dominante caravaggismo come nei quadri dei giovani Battistello Caracciolo e Jusepe de Ribera ai quali si devono i capolavori assoluti della collezione: al primo spetta il Battesimo di Cristo, al secondo la serie di ritratti di apostoli San Pietro, San Paolo, San Giacomo, a cui probabilmente si aggiungevano altri ritratti poi scomparsi o trafugati, il Sant'Andrea e la Flagellazione di Cristo. Arricchiscono la pinacoteca pitture di scuola parmense tra cui spiccano due capolavori di Guido Reni Fuga in Egitto e Incontro di Cristo con il Battista, ed opere di Fabrizio Santafede e Giovanni Bernardo Azzolino i cui stili ricalcano il manierismo toscano. Settecenteschi sono i bozzetti per gli affreschi di Mosè e David della chiesa monumentale di Francesco Solimena e le opere di Ludovico Mazzanti raffiguranti la Morte di Ozia e laCacciata di Eliodoro, copie degli affreschi compiuti dallo stesso pittore per la chiesa dei Girolamini.
Durante la riorganizzazione museale effettuata negli anni Novanta, sono state inserite nuove opere; tra queste notevoli sono un busto in terracotta di San Filippo e due Pietà delSanmartino.
